Las condiciones para poblar las gobernaciones de Casilla de Oro y Nueva Andalucía no eran muy propicias para los españoles. La población indígena no era muy numerosa y se hallaba dispersa en un territorio de difícil penetración. Cualquier asentamiento era víctima de ataques constantes y así, las primeras aldeas vivían sumidas en la incertidumbre. A la fundación de Santa María la Antigua (1510), se sumaron Nombre de Dios en el Darién (remplazada posteriormente por Portobelo), San Sebastián en Urabá (1510), Panamá (1519), Guatemala (1524), Coro (1527), Cartagena de Indias (1533) y Santa Fe de Bogotá (1538), estas tres últimas en Colombia.

Al contrario de lo sucedido en las Antillas, en la conquista de Tierra Firme y Centroamérica se inauguró un nuevo instrumento jurídico para justificar el dominio hispano sobre la población aborigen. Mediante un documento elaborado por consejeros del rey en España , denominado "Requerimiento", se pretendía dar un carácter legal a la ocupación de nuevos territorios. El requerimiento era un texto, donde se explicaba a los indígenas los derechos que poseían los españoles para apoderarse de sus tierras, se los exhortaba a adoptar el catolicismo como religión verdadera y reconocerse como súbditos de la corona española. Sin embargo, el requerimiento, que era leído públicamente a los caciques, no era comprendido por los indígenas y, en definitiva, daba lugar a la conquista por las armas, considerada como una "guerra justa" por los invasores.

Los nativos de Centroamérica y Colombia fueron objeto de idénticos abusos que los taínos de las Antillas. Muchos fueron esclavizados u obligados a trabajar explotando oro en provecho de los españoles o cultivando los campos para su mantención. En un primer momento, hasta más o menos mediados del siglo XVI, gran parte de los esclavos eran llevados a las Antillas para trabajar en las faenas azucareras.

Por otra parte, en las costas de Colombia y Venezuela, empezó a proliferar un nuevo negocio muy lucrativo: la explotación de perlas. Esta se localizó principalmente en las islas de Cubagua, Margarita y Cabo de la Vela y proporcionó importantes ganancias hasta la década de 1550. Las perlas se obtenían gracias a buceadores indígenas que eran obligados a sumergirse en las profundidades para sacar las perlas a las ostras. Luego, los cargamentos de perlas eran embarcados y enviados a España. Otras actividades económicas fueron la minería del oro, que se comenzó a practicar en la segunda mitad del siglo XVI, y la explotación de salinas que revistió singular importancia en Venezuela.

En Centroamérica, en tanto, cobró especial trascendencia el comercio. Portobelo y Panamá se transformaron rápidamente en centros distribuidores y puntos de llegada de los productos que arribaban desde México y Perú y tomaban rumbo a España.

Célebres fueron, a partir de la segunda mitad del siglo XVI, las ferias de Portobelo, donde acudían los mercaderes de las diferentes gobernaciones que formaban parte del imperio colonial hispano.