La conquista de la escasamente explorada América meridional arrancó desde el Perú y tuvo dos vertientes principales: Chile y el Río de la Plata. Se trataba de tierras remotas con límites imprecisos que llegaban hasta el Estrecho de Magallanes, recorrido por este navegante en 1520. La información sobre la población aborigen era igualmente deficiente e incluso circulaban rumores acerca de la existencia de magnificas riquezas. Estos rumores eran alimentados por los incas, para incitar a los españoles a dejar el Perú y proseguir su marcha hacia el sur.
El primero que se aventuró fue el adelantado Diego de Almagro, quien salió del Cuzco en julio de 1535 acompañado por 1.200 hombres. Luego de una penosa travesía por el altiplano, cruzó los Andes y arribó a la región de Copiapó al año siguiente. No pudo permanecer en esas tierras, denominadas Chile, debido a la rebelión de Manco Inca y la ausencia de centros urbanos indígenas de consideración.
El capitán extremeño Pedro de Valdivia, distinguido en las guerras civiles del Perú, dirigió y financió en gran parte la expedición que concluiría en la conquista del centro de Chile, el reconocimiento de Cuyo y del Tucumán. Sin mayores dificultades sometió a los atacameños y diaguitas del norte de Chile y a agrupaciones nativas menores del centro del territorio. Después de cruzar el árido desierto de Atacama, siguiendo uno de los tantos caminos incas, fundó en 1541 la ciudad de Santiago del Nuevo Extremo en el valle del río Mapocho.
Luego de esta fundación Valdivia se dirigió al sur, donde habitaban los mapuches. La intención era extender sus dominios al máximo, razón por la cual se establecieron numerosos asentamientos que dispersaron sus escasas fuerzas en un vasto territorio. Si bien en un comienzo Valdivia no encontró una resistencia indígena organizada, pronto los nativos reaccionaron con las armas frente a la presencia hispana. Ya en 1550 se registró el primer gran combate entre mapuches y españoles en torno al río Biobío; solo era el comienzo de una larga guerra que se extendería hasta mediados del siglo XVII. El año de 1553 se produjo un importante levantamiento de los indígenas de las regiones de Arauco y Tucapel. Valdivia fue muerto y la conquista de Chile se tornó inestable, situación que se mantuvo durante gran parte del siglo XVI.
La región del Río de la Plata no se incorporó sino hacia fines del siglo XVI, debido al poco interés que despertó en los expedicionarios que se concentraron en Perú y Chile, tierras que ofrecían mayores riquezas. Fundamentalmente para evitar el asentamiento de los portugueses en la zona, se procedió a la fundación de algunas ciudades a partir de Asunción, misión encomendada a Juan de Garay desde 1573. La dispersión y escasez de la población indígena caracterizó el proceso que se desarrolló sin mayores conmociones, en comparación con otras zonas de América.