Una vez consolidado el dominio hispano en las Antillas, concretamente en La Española, algunos capitanes ávidos de riqueza, honra y poder consiguieron autorizaciones de la corona para realizar las llamadas empresas de rescate. Se trataba de tomar contacto con los indígenas de Tierra Firme (actualmente las costas atlánticas de Centroamérica y Colombia), para intercambiar con ellos chucherías por oro. Los contactos esporádicos fueron aumentando hasta que Alonso de Ojeda y Diego de Nicuesa obtuvieron del rey el título de gobernadores de Urabá o Nueva Andalucía (costa noroeste de Colombia) y Veragua o Castilla de Oro (costa atlántica de Panamá, llamada Darién) respectivamente en 1508. La primera ciudad fundada en el continente americano fue Santa María la Antigua del Darién en 1510, la cual se constituyó en el centro de la gobernación de Castilla de Oro.

La conquista de estas áreas tuvo un carácter muy frágil, especialmente en la costa colombiana. Ello debido a la impenetrable selva costera, el riguroso clima subtropical y las numerosas tribus nativas que dispersaban a los españoles con sus ataques por sorpresa y les causaban muchas bajas producto de sus flechas envenenadas. En esta segunda plataforma de conquista sobresalió la figura de Vasco Núñez de Balboa, quien arribó en 1510 a Tierra Firme. Gracias a su iniciativa y don de mando rápidamente se ganó el aprecio de los soldados y constituyó un liderazgo opuesto a Ojeda y Nicuesa. Desde Santa María la Antigua realizó varias expediciones en dirección al Darién, donde trabó amistad con algunos caciques indígenas de la zona y obtuvo las primeras noticias del Océano Pacífico y de un reino llamado Pirú, ubicado al sur.

En 1513, al frente de 190 españoles y 810 indígenas, Balboa se dirigió al istmo de Panamá. Tras una penosa marcha, los 67 sobrevivientes de la comitiva vislumbraron desde las alturas el Mar del Sur, que luego recibió el nombre de Océano Pacífico. Al fin se había alcanzado uno de los objetivos del ciclo colombino: encontrar un paso para poder acceder a las lejanas Islas Orientales de las especies.

Todo estaba dado para que Balboa asumiera el gobierno de Castilla de Oro y continuara la conquista en esa región. No obstante, intrigas cortesanas motivaron el nombramiento de Pedro de Arias Dávila, conocido después como el Furor Domini Pedrarias, en calidad de gobernador. Arribó a sus dominios en 1514, acompañado por 1.200 hombres destinados a colonizar el Darién.
No tardaron en generarse los conflictos de poder entre Balboa y Pedrarias y, a pesar de que el primero se convirtió en yerno del gobernador, fue apresado y acusado de traición. En 1519, Balboa fue ejecutado en la recientemente fundada ciudad de Panamá, frente al mar que él había avistado unos años antes.

Desde Panamá, Pedrarias prosiguió la incorporación de territorios a su gobernación, agregando en la década de 1520 las actuales zonas de Nicaragua y Honduras. Pedro de los Ríos, sucesor de Pedrarias, afianzó la conquista y autorizó nuevas expediciones por el Pacífico. Colombia y Venezuela, mientras tanto, no fueron colonizadas y solamente sirvieron de refugio a los buscadores de perlas que se concentraron en las islas de Cubagua y Margarita. La conquista definitiva del interior colombiano recién se concretaría a partir de la segunda mitad del siglo XVI.